熒光技術(shù)在生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究中的作用

　　1、物質(zhì)的定性：不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可用熒光進(jìn)行物質(zhì)的鑒別。與吸收光譜法相比，熒光法具有更高的選擇性。 　

　　2、定量測(cè)定：利用在較低濃度下熒光強(qiáng)度與樣品濃度成正比這一關(guān)系可以定量分析樣品中熒光組分的含量，常用于測(cè)定氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸的含量。熒光定量測(cè)定的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，例如維生素B2的測(cè)定*可達(dá)1毫微克/毫升，這一優(yōu)點(diǎn)使測(cè)定時(shí)所需要樣品量大大減少。 　這種定量測(cè)定方法還可應(yīng)用于酶催化的反應(yīng)，只要反應(yīng)前后有熒光強(qiáng)度的變化，就可用來(lái)測(cè)定酶的含量及酶反應(yīng)的速率等。 　

　　3、研究生物大分子的物理化學(xué)特性及其分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象：熒光的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率和熒光壽命等參數(shù)不僅和分子內(nèi)熒光發(fā)色基團(tuán)的本身結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且還強(qiáng)烈地依賴于發(fā)色團(tuán)周?chē)沫h(huán)境，即對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感。利用此特點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定上述有關(guān)熒光參數(shù)的變化來(lái)研究熒光發(fā)色團(tuán)所在部位的微環(huán)境的特征及其變化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的熒光發(fā)色團(tuán)（如色氨酸、酪氨酸、鳥(niǎo)苷酸等，此類(lèi)熒光稱(chēng)為內(nèi)源熒光）以外，可將一些特殊的熒光染料分子共價(jià)地結(jié)合或吸附在生物大分子的某一部位，通過(guò)測(cè)定該染料分子的熒光特性變化來(lái)研究生物大分子，這種染料分子被稱(chēng)為“熒光探針”，它們發(fā)出的熒光一般稱(chēng)為外源熒光。熒光探針的應(yīng)用，大大地開(kāi)拓了熒光技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用范圍。　 　

　　4、利用熒光壽命、量子產(chǎn)率等參數(shù)可以研究生物大分子中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象：通過(guò)該現(xiàn)象的研究，可以獲得生物大分子內(nèi)部的許多信息。

　　以往人們常用熒光偏振做指標(biāo)來(lái)研究生物大分子動(dòng)力學(xué)。人們趨于用熒光偏振隨時(shí)間的衰減來(lái)研究這些問(wèn)題。在這種方法中，激發(fā)光不是一連續(xù)的面偏振光，而是一偏振的光脈沖，因此測(cè)得的F∥和F是在兩個(gè)不同方向上偏振的熒光隨時(shí)間的衰減，它既和熒光壽命τ有關(guān)，又與分子在溶液中的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，因此常表示為F∥（t）和F⊥（t）。由它們可得一相當(dāng)重要的物理量——各向異性參數(shù)A（t）。由A（t）可推測(cè)生物大分子的形狀、分子轉(zhuǎn)動(dòng)弛豫時(shí)間（即從一個(gè)定向的狀態(tài)到一個(gè)無(wú)定向狀態(tài)所要的時(shí)間），進(jìn)而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的轉(zhuǎn)動(dòng)角度和時(shí)間之間的函數(shù)關(guān)系。由這些結(jié)果可以研究分子之間的相互作用、分子間結(jié)合的緊密程度、蛋白質(zhì)、核酸分子的解聚程度等等。 　

　　另外，熒光技術(shù)在免疫學(xué)中亦有廣泛的應(yīng)用。zui重要的就是熒光抗體法。將某些熒光染料與血清抗體相結(jié)合，這種標(biāo)記的抗體仍可專(zhuān)一地與相應(yīng)抗原發(fā)生結(jié)合，形成的復(fù)合體具有熒光特性，從而可以確定抗原或抗體的存在及其含量。